Контактная информация

119334 г. Москва, ул. Бардина, 4 стр. 23

---Исследование ингибирующего и разрушающего действия препарата наночастиц серебра на биопленки, сформированные клинически значимыми микроорганизмами

Исследование ингибирующего и разрушающего действия препарата наночастиц серебра на биопленки, сформированные клинически значимыми микроорганизмами

28 июня 2021

ИССЛЕДОВАНИЕ ИНГИБИРУЮЩЕГО И РАЗРУШАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТА НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА НА БИОПЛЕНКИ, СФОРМИРОВАННЫЕ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ

Сухина М.А.1, Шелыгин Ю.А.1,4, Пиядина А.Ю.1,2, Фельдман Н.Б.2, Ананян М.А.3, Луценко С.В.2, Фролов С.А.1
1 ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России, г. Москва, Россия (директор – чл.-корр. РАН, профессор Ю.А. Шелыгин)
2 ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), г. Москва, Россия (ректор – академик РАН, профессор П.В. Глыбочко)
3 ЗАО «Концерн «Наноиндустрия», г. Москва, Россия (генеральный директор – д.т.н. М.А. Ананян)
4 ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, г. Москва, Россия (ректор – член-корр. РАН, Д.А. Сычев)

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Получить и исследовать активность стабилизированных арабиногалактаном наночастиц серебра в отношении клинически значимых штаммов пленкообразующих микроорганизмов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Наночастицы серебра получали методом восстановления из нитрата серебра в присутствии арабиногалактана с дополнительной стабилизацией диоктилсульфосукцинатом натрия. Форму и размеры наночастиц определяли методом просвечивающей электронной микроскопии, дзета-потенциал – методом электрофоретического рассеяния света. Исследование влияния препарата наночастиц на биопленкообразование проводили на 17 клинически значимых штаммах бактерий, изолированных из гемокультуры и клинического биоматериала послеоперационных пациентов колопроктологического стационара. РЕЗУЛЬТАТЫ. Получен препарат наночастиц серебра, характеризующихся средним диаметром 11,4 нм и дзета-потенциалом – 24 мВ. Минимальная ингибирующая концентрация препарата наночастиц в отношении планктонных культур бактерий составляла 120 мкг/мл; применение препарата в концентрации 100 мкг/мл снижало показатель КОЕ/мл на 7 порядков по сравнению с исходной культурой. Изучение влияния наночастиц серебра на процесс формирования биопленок показало, что в присутствии препарата процесс роста биопленок значительно снижался; при концентрации препарата 150 мкг/мл происходило полное подавление роста бактериальных пленок. Инкубация сформированных суточных биопленок с препаратом наночастиц серебра в диапазоне концентраций от 150 до 120 мкг/мл в течение 48 ч приводила к частичному или полному разрушению биополимерного матрикса. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Исследуемый препарат наночастиц серебра обладает большим потенциалом применения в терапии инфекционных заболеваний, вызванных пленкообразующими микроорганизмами.
[Ключевые слова: биопленки, наночастицы серебра, антимикробная активность, клинические изоляты, катетер-ассоциированная инфекция, послеоперационные раны]

Для цитирования: Сухина М.А., Шелыгин Ю.А., Пиядина А.Ю., Фельдман Н.Б., Ананян М.А., Луценко С.В., Фролов С.А. Исследование ингибирующего и разрушающего действия препарата наночастиц серебра на биопленки, сформированные клинически значимыми микроорганизмами. Колопроктология. 2019; т. 18, № 3(69), с. 56-70.

THE INHIBITORY AND DESTRUCTIVE ACTION OF THE SILVER NANOPARTICLE PREPARATION ON BIOFILMS FORMED BY CLINICALLY RELEVANT MICROORGANISMS

Sukhina M.A.1, Shelygin Yu.A.1,4, Piyadina A.Yu.1,2, Feldman N.B.2, Ananyan M.A.3, Lutsenko S.V.2, Frolov S.A.1
1 State Scientific Centre of Coloproctology of the Ministry of Healthcare of Russia, Moscow, Russia (director – corresponding member of RAS, Professor Yu.A. Shelygin)
2 Sechenov University, Moscow, Russia (rector – academician of RAS, professor P.V. Glybochko)
3 «Nanoindustry Concern JSC», Moscow, Russia (general director –doctor of technology M.A. Ananyan)
4 Russian Medical Academy of Continuous Professional Education of the Ministry of Healthcare of Russia, Moscow, Russia (rector – corresponding member of RAS, D.A. Sychev)

AIM: to obtain and investigate the activity of silver nanoparticles stabilized with arabinogalactan in relation to clinically relevant strains of filmforming microorganisms. MATERIALS AND METHODS: silver nanoparticles were obtained by reduction from silver nitrate in the presence of arabinogalactan with additional stabilization with dioctyl sodium sulfosuccinate. The shape and size of the nanoparticles were determined by the method of transmission electron microscopy, the zeta potential by the method of electrophoretic light scattering. The study of the effect of the nanoparticles on biofilm formation was carried out on 17 clinically relevant strains of bacteria isolated from blood culture and the clinical biomaterial of postoperative patients. RESULTS: the silver nanoparticles with an average diameter of 11.4 nm and a zeta potential of –24 mV were obtained. The minimum inhibitory concentration of the nanoparticles in relation to planktonic form of bacteria was 120 mg/ml; the use of the drug at a concentration of 100 mg/ ml reduced the amount of CFU by 7 orders of magnitude compared with the initial culture. The study of the effect of silver nanoparticles on the formation of biofilms showed that, in the presence of the drug, the growth of biofilms was significantly reduced; at a drug concentration of 150 mg/ml, the growth of bacterial films was completely suppressed. Incubation of the formed daily biofilms with the silver nanoparticles in the concentration range from 150 to 120 mg/ml for 48 h resulted in the partial or complete destruction of the biopolymer matrix. CONCLUSION: the studied preparation of silver nanoparticles has a great potential for use in the treatment of infectious diseases caused by biofilm forming microorganisms.
[Keywords: biofilms, silver nanoparticles, antimicrobial activity, clinical isolates,catheter-associated infection, postoperative wounds]

For citation: Sukhina M.A., Shelygin Yu.A., Piyadina A.Yu., Feldman N.B., Ananyan M.A., Lutsenko S.V., Frolov S.A. The inhibitory and destructive action of the silver nanoparticle preparation on biofilms formed by clinically relevant microorganisms. Koloproktologia. 2019; v. 18, № 3(69), pp. 56-70.

Адрес для переписки: Сухина М.А., ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России, ул. Саляма Адиля, д. 2, Москва, 123423; e-mail: antonyz@rambler.ru

ВВЕДЕНИЕ

Одной из серьезных проблем современной медицины является множественная лекарственная устойчивость патогенов, значительно снижающая эффективность антимикробной антибиотикотерапии [10,24]. Полирезистентность представляет собой комплексный механизм, конкретная реализация которого зависит от особенностей организма, штамма возбудителя инфекционного заболевания, применяемого антибиотика и других факторов [2]. Поиск новых препаратов, в том числе средствами нанотехнологий, позволяющих снизить риск развития или преодолеть множественную лекарственную устойчивость, а, следовательно, значительно повысить эффективность терапии опасных инфекционных заболеваний, представляется чрезвычайно важной задачей [6].

Многие гнойно-воспалительные заболевания и послеоперационные осложнения связаны с антибиотикорезистентными пленкообразующими микроорганизмами, значительно более резистентными по сравнению с планктонными формами [4]. Формирование биопленок патогенными микроорганизмами способствует инфекционным поражениям как органов человека, так и искусственных имплантатов. Биопленки представляют собой структуры, образуемые микробными сообществами на поверхности раздела фаз, например, жидкой и твердой, жидкой и газообразной и т.д. [13,20]. Важно отметить, что биопленки.

могут формироваться как бактериями одного вида, так и представлять собой сообщества, включающие несколько видов бактерий и других микроорганизмов. Само микробное сообщество состоит из клеток, заключенных в синтезированный ими внеклеточный полимерный матрикс (экзополимерный матрикс). Биопленки играют важнейшую роль в процессе перехода инфекционного заболевания из острой фазы в хроническую, являясь причиной значительных затруднений на пути проведения эффективной терапии большого числа патологий. В связи с этим, поиск средств, препятствующих образованию биопленок и поражающих бактерии внутри них, является важной задачей современной антимикробной терапии [23]. В качестве перспективного средства терапии инфекционных и гнойно-воспалительных заболеваний, как альтернативы антибиотикам, в настоящее время активно изучаются свойства наночастиц металлического серебра, проявляющие широкий спектр антимикробной активности при отсутствии резистентности к ним [7,21].

Токсическое действие на бактериальные клетки в существенной мере определяется размером, формой, концентрацией, природой стабилизатора наночастиц, а также их способностью генерировать активные формы кислорода [9,15]. Наночастицы серебра способны сорбироваться на поверхности бактериальной клетки, оказывать повреждающее действие на плазматическую мембрану и вызывать гибель клетки. Наночастицы серебра могут также проникать внутрь бактериальных клеток и оказывать повреждающее действие на внутриклеточные структуры, рибосомальные субчастицы, нуклеиновые кислоты и белки [7,16,26].

В ряду механизмов токсического действия наночастиц серебра на бактерии важнейшим их свойством является способность разрушать экзополимерный матрикс биопленки [11,25]. Это свойство приобретает дополнительную значимость, исходя из факта отсутствия резистентности к наносеребру у биопленок, продуцируемых мультирезистентными бактериями [19,22]. Характер и эффективность токсического действия наночастиц серебра в отношении пленкообразующих микроорганизмов во многом определяется природой стабилизурующих биополимеров. В настоящее время продемонстрирована цитотоксическая активность наночастиц серебра, стабилизированных цитратом [12], циклодекстрином [14], поливинилпирролидоном [5] и крахмалом [17] в отношении Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri, Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Escherichia coli и др. Одним из перспективных биополимеров, которые могут применяться для восстановления металлических наночастиц из солей серебра и их стабилизации, является природный водорастворимый, нетоксичный, легко доступный арабиногалактан из лиственницы сибирской (Larix sibirica L.) и портулака огородного (Portulaca oleracea) [3, 18]. Стерическая стабилизация поверхности наночастиц арабиногалактаном может позволить значительно повысить их стабильность и при сохранении высокой антимикробной активности снизить токсические эффекты на организм человека.

Таким образом, проблема борьбы с резистентными пленкообразующими бактериями диктует необходимость разработки действенных препаратов, способных разрушать экзополимерный матрикс биопленки и эффективно поражать бактериальные клетки. Разработка подходов к получению и изучению антимикробной активности наночастиц серебра в отношении пленкообразующих клинических штаммов микроорганизмов является актуальной задачей. В данной работе нами были получены и охарактеризованы стабилизированные арабиногалактаном наночастицы серебра. Изучена их активность в отношении клинически значимых штаммов пленкообразующих микроорганизмов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение и характеристика наночастиц серебра

Для синтеза наночастиц серебра использовали нитрат серебра, гидроксид аммония (27%), диоктилсульфо сукцинат натрия (Aerosol-OT, или бис (2-этилгексил) сульфосукцинат, натриевая соль) (Labtex, Russia), арабиногалактан (Fluka).

Синтез наночастиц металлического серебра проводили методом восстановления из нитрата серебра в щелочной среде в присутствии арабиногалактана. К 0,2% раствору арабиногалактана, нагретому до 90°С, при интенсивном перемешивании добавляли раствор нитрата серебра. Реакцию восстановления серебра проводили в течение 40 мин. при той же температуре и рН≥10,0, с последующим добавлением диоктилсульфосукцината натрия и постепенным охлаждением раствора до комнатной температуры. Определение электрокинетического потенциала наночастиц серебра проводили методом электрофоретического рассеяния света на анализаторе Photocor compact Z (Россия).

Исследования методами просвечивающей электронной микроскопии проводили с помощью микроскопа LEO 912 AB (Carl Zeiss, Германия). Исследования проведены при ускоряющем напряжении 100 кВ. Для приготовления образцов каплю золя наносили на медные сетки диаметром 3,05 мм, покрытые тонкой полимерной пленкой-подложкой, и высушивали при комнатной температуре. Распределение наночастиц серебра по размерам определяли путем обработки полученных микрофотографий при помощи программы анализа оптических изображений UTHSCSA Image Tool 3.00.

Штаммы микроорганизмов

Для исследования были выбраны клинически значимые штаммы микроорганизмов, которые наиболее часто встречались в качестве возбудителей нозокомиальных и хронических инфекций; также эти бактерии характеризовалисьрезистентностью к бета-лактамным антибиотикам (Табл. 1). Исследуемые бактерии были изолированы из гемокультуры и различного клинического биоматериала пациентов, перенесших оперативное лечение по поводу колопроктологических заболеваний. Было изучено 17 штаммов, относящихся к разным видам для выявления возможных различий взаимодействия с препаратом.

Изучение воздействия наночастиц серебра на клинические изоляты

1) Воздействие препарата наночастиц серебра на планктонную форму клеток микроорганизмов. Для определения чувствительности к наночастицам серебра проводили измерение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) в 96-луночных полистироловых планшетах, используя метод последовательных двукратных разведений. Бактериальную суспензию готовили в физиологическом растворе; плотность суспензии соответствовала 1 McF (3,3×108 КОЕ/мл). Разведения препарата наночастиц сереб ра осуществляли в сердечно-мозговом экстракте в диапазоне концентраций от 150 до 1,6 мкг/мл. Инкубировали бактериальные суспензии с препаратом в различных концентрациях в течение 48 ч при 37°С. Количественную оценку ингибирования роста микроорганизмов проводили с помощью метода серийных разведений с последующим высевом на плотную питательную среду (триптон-соевый агар) и подсчетом КОЕ/мл после инкубации при 37°С 24 ч.

2) Ингибирование формирования бактериальных биопленок препаратом наночастиц серебра.

По описанной выше методике готовили бактериальные суспензии из суточных культур плотностью 1,0 McF с добавлением препарата наночастиц серебра в различных концентрациях. По 1 мл суспензии наносили на покровные стекла, выдерживали 4 ч для закрепления клеток, после чего добавляли 5 мл среды для биофильмогенеза (пептон-дрожжевой экстракт) и инкубировали стекла в термостате 48 ч при 37°С.

3) Разрушение суточных биопленок препаратом наночастиц серебра.

По 1 мл бактериальной суспензии 1,0 McF наносили на покровные стекла, выдерживали 4 ч для закрепления клеток, после чего добавляли 5 мл среды для биофильмогенеза и инкубировали 24 ч при 37°С. На стекла со сформировавшимися биопленками наносили по 1 мл исследуемого препарата в различных концентрациях и инкубировали еще 48 ч.

Биопленки окрашивали альциановым синим и проводили микроскопию в световом микроскопе разрешением ×1000. Степень формирования биопленки оценивали по разработанной условной 4-х балльной шкале, основанной на характере роста и степени покрытия стекла бактериальной пленкой [1]. В качестве контроля использовали биопленочные культуры, которые получали в идентичных условиях, но без добавления наночастиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Золь серебра был получен восстановлением нитрата серебра с помощью арабиногалактана, который одновременно выступал как в роли восстановителя, так и стабилизатора наночастиц. Для повышения устойчивости золя серебра к полученному препарату добавляли диоктилсульфосукцинат натрия. По данным просвечивающей электронной микроскопии полученный препарат содержал наночастицы серебра сферической формы (Рис. 1). Средний диаметр наночастиц составлял 11,4 нм (Рис. 2); дзета-потенциал –24 мВ.

На первом этапе была изучена эффективность действия препарата наночастиц на планктонные культуры микроорганизмов. В присутствии препарата в концентрации 75 мкг/мл показатель КОЕ/мл в случае всех исследуемых штаммов оказался на 1-2 порядка ниже по сравнению с контролем; при более низких концентрациях препарата планктонный рост оставался неизменным. При увеличении концентрации нано
частиц до 100 мкг/мл было зафиксировано резкое снижение показателя КОЕ/мл на 7 порядков (Табл. 2), что свидетельствует о высокой бактерицидной способности наночастиц серебра. При концентрации 120 мкг/мл планктонного роста микроорганизмов не наблюдалось.

Полученные результаты свидетельствуют, что минимальная ингибирующая концентрация (МИК) препарата наночастиц составляет 120 мкг/мл. Следует отметить, что разные представители одного рода микроорганизмов при взаимодействии с препаратом демонстрируют сходные реакции (Табл. 2). Далее мы исследовали влияние препарата наночастиц серебра на процесс формирования биопленок. Исследуемые штаммы бактерий в контрольных образцах, без воздействия ингибирующих факторов, за 48 ч формировали биопленки 3-4 степени согласно нашей оценочной шкале (Рис. 3). В присутствии наночастиц серебра процесс роста биопленок значительно снижался и в концентрациях от 120 мкг/мл и выше и оценивался ниже первой степени (Табл. 3). При добавлении препарата наночастиц в концентрации 150 мкг/мл происходило полное подавление роста бактериальных пленок (Рис. 3).

Антибактериальные агенты, эффективные при ингибировании еще не сформировавшейся биопленки, зачастую могут оказаться неэффективными в отношении микроорганизмов, уже заключенных в пленочный матрикс. В нашем исследовании инкубация сформированных суточных биопленок с препаратом наночастиц серебра в диапазоне концентраций от 150 до 120 мкг/мл в течение 48 ч приводила к частичному или полному разрушению биополимерного матрикса (Табл. 4).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты свидетельствуют, что препарат стабилизированных биополимером арабиногалактаном наночастиц серебра проявляет антибактериальную активность в отношении планктонных культур всех исследованных штаммов, подавляет.

ЛИТЕРАТУРА

REFERENCE

1. Сухина М.А., Калашникова И.А., Кашников В.Н. и соавт. Влияние антибактериальных веществ на рост биопленки клинических изолятов. Колопроктология. 2018; № 2(64), с. 78-84.
2. Andersson DI, Hughes D. Antibiotic resistance and its cost: is it possible to reverse resistance? Nat. Rev. Microbiol. 2010; 8(4): 260271.
3. Anuradha K, Bangal P, Madhavendra SS. Macromolecular arabinogalactan polysaccharide mediated synthesis of silver nanoparticles, characterization and evaluation. Macromolecular Res. 2016; 24(2): 152-162.
4. Bowler PG, Welsby S, Towers V. et al. Multidrug-resistant organisms, wounds and topical antimicrobial protection. Int. Wound J. 2012;9(4):387-396.
5. Bryaskova R, Pencheva D, Nikolov S. et al. Synthesis and comparative study on the antimicrobial activity of hybrid materials based on silver nanoparticles (AgNps) stabilized by polyvinylpyrrolidone (PVP). J. Chem. Biol. 2011;4(4):185-191.
6. Cassir N, Rolain JM, Brouqui P. A new strategy to fight antimicrobial resistance: the revival of old antibiotics. Front. Microbiol. 2014; 5: 551.
7. Chaloupka K, Malam Y, Seifalian AM. Nanosilver as a new generation of nanoproduct in biomedical applications. Trends Biotechnol. 2010;28(11):580-588.
8. Chernousova S, Epple M. Silver as antibacterial agent: ion, nanoparticle, and metal. Angew. Chem. Int. Ed. 2013;52: 1636-1653.
9. Choi O, Hu Z. Environ. Size dependent and reactive oxygen species related nanosilver toxicity to nitrifying bacteria. Sci. Technol. 2008; 42(12):4583-4588.
10. Dantes R, Mu Y, Belflower R. et al. Emerging Infections Program– Active Bacterial Core Surveillance MRSA Surveillance Investigators. National burden of invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections, United States, 2011. JAMA Intern. Med. 2013; 173(21): 1970-1978.
11. Gurunathan S, Han JW, Kwon DN et al. Enhanced antibacterial and anti-biofilm activities of silver nanoparticles against Gram-negative and Gram-positive bacteria. Nanoscale Res. Lett. 2014;9(1):373. 12. Habash MB, Park AJ, Vis EC et al. Synergy of silver nanoparticles and aztreonam against Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 2014; 58(10): 5818-5830.
13. Hall-Stoodley L, Costerton JW, Stoodley P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2004; 2(2):95-108.
14. Jaiswal S, Bhattacharya K, McHale P et al. Dual effects of b-cyclodextrin-stabilised silver nanoparticles: enhanced biofilm inhibition and reduced cytotoxicity. J. Mater. Sci. Mater. Med. 2015;26(1): 52. 15. Lazar V. Quorum sensing in biofilms – how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 2011;17(6):280-285.
16. Li WR, Xie XB, Shi QS et al. Antibacterial activity and mechanism of silver nanoparticles on Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010; 85:1115-1122.
17. Mohanty S, Mishra S, Jena P et al. An investigation on the antibacterial, cytotoxic, and antibiofilm efficacy of starch-stabilized silver nanoparticles. Nanomedicine. 2012;8: 916-924.
18. Neverova NA, Levchuk AA, Ostroukhova LA et al. Distribution of extractive substances in wood of the Siberian larch (Larix sibirica Ledeb.). Russ. J. Bioorganic Chem. 2013;39 (7): 712-719.
19. Palanisamy NK, Ferina N, Amirulhusni AN et al. Antibiofilm properties of chemically synthesized silver nanoparticles found against Pseudomonas aeruginosa. J. Nanobiotechnol. 2014; 12: 2.
20. Periasamy S, Joo HS, Duong AC et al. How Staphylococcus aureus biofilms develop their characteristic structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109(4): 1281-1286.
21. Rai MK, Deshmukh SD, Ingle AP et al. Silver nanoparticles: the powerful nanoweapon against multidrug-resistant bacteria. J. Appl. Microbiol. 2012;112(5): 841-852.
22. Silver S. Bacterial silver resistance: molecular biology and uses and misuses of silver compounds. FEMS Microbiol. Rev. 2003; 27(2-3): 341-353.
23. Taraszkiewicz A, Fila G, Grinholc M et al. Innovative strategies to overcome biofilm resistance. Biomed. Res. Int. 2013; p. 150653.
24. Walker B, Barrett S, Polasky S et al. Environment. Looming globalscale failures and missing institutions. Science. 2009; 325(5946): 1345-1346.
25. Wu D, Fan W, Kishen A et al. Evaluation of the antibacterial efficacy of silver nanoparticles against Enterococcus faecalis biofilm. J. Endod. 2014; 40(2):285-290.
26. Zhang XF, Liu ZG, Shen W et al. Silver Nanoparticles: Synthesis, Characterization, Properties, Applications, and Therapeutic Approaches. Int. J. Mol. Sci. 2016; 17(9): pii: E1534.

THE INHIBITORY AND DESTRUCTIVE ACTION OF THE SILVER NANOPARTICLE PREPARATION ON BIOFILMS FORMED BY CLINICALLY RELEVANT MICROORGANISMS
Sukhina M.A.1, Shelygin Yu.A.1,4, Piyadina A.Yu.1,2, Feldman N.B.2, Ananyan M.A.3, Lutsenko S.V.2, Frolov S.A.1
1 State Scientific Centre of Coloproctology of the Ministry of Healthcare of Russia, Moscow, Russia (director – corresponding member of RAS, Professor Yu.A. Shelygin)
2 Sechenov University, Moscow, Russia (rector – academician of RAS, professor P.V. Glybochko)
3 «Nanoindustry Concern JSC», Moscow, Russia (general director –doctor of technology M.A. Ananyan)
4 Russian Medical Academy of Continuous Professional Education of the Ministry of Healthcare of Russia, Moscow, Russia (rector – corresponding member of RAS, D.A. Sychev)

AIM: to obtain and investigate the activity of silver nanoparticles stabilized with arabinogalactan in relation to clinically relevant strains of filmforming microorganisms. MATERIALS AND METHODS: silver nanoparticles were obtained by reduction from silver nitrate in the presence of arabinogalactan with additional stabilization with dioctyl sodium sulfosuccinate. The shape and size of the nanoparticles were determined by the method of transmission electron microscopy, the zeta potential by the method of electrophoretic light scattering. The study of the effect of the nanoparticles on biofilm formation was carried out on 17 clinically relevant strains of bacteria isolated from blood culture and the clinical biomaterial of postoperative patients. RESULTS: the silver nanoparticles with an average diameter of 11.4 nm and a zeta potential of –24 mV were obtained. The minimum inhibitory concentration of the nanoparticles in relation to planktonic form of bacteria was 120 mg/ml; the use of the drug at a concentration of 100 mg/ ml reduced the amount of CFU by 7 orders of magnitude compared with the initial culture. The study of the effect of silver nanoparticles on the formation of biofilms showed that, in the presence of the drug, the growth of biofilms was significantly reduced; at a drug concentration of 150 mg/ml, the growth of bacterial films was completely suppressed. Incubation of the formed daily biofilms with the silver nanoparticles in the concentration range from 150 to 120 mg/ml for 48 h resulted in the partial or complete destruction of the biopolymer matrix. CONCLUSION: the studied preparation of silver nanoparticles has a great potential for use in the treatment of infectious diseases caused by biofilm forming microorganisms.
[Keywords: biofilms, silver nanoparticles, antimicrobial activity, clinical isolates,catheter-associated infection, postoperative wounds]

For citation: Sukhina M.A., Shelygin Yu.A., Piyadina A.Yu., Feldman N.B., Ananyan M.A., Lutsenko S.V., Frolov S.A. The inhibitory and destructive action of the silver nanoparticle preparation on biofilms formed by clinically relevant microorganisms. Koloproktologia. 2019; v. 18, № 3(69), pp. 56-70.

Address for correspondence: Sukhina, M.A., State Scientific Centre of Coloproctology of the Ministry of Healthcare of Russia, Salyama Adilya str., 2, Moscow, 123423; e-mail: antonyz@rambler.ru

INTRODUCTION

One of the serious problems of modern medicine is the multiple drug resistance of pathogens significantly reducing the effectiveness of antibiotic therapy [10,24]. Polyresistance is a complex mechanism, the specific implementation of which depends on the characteristics of the organism, the strain of infectious disease, the antibiotic used and other factors [2]. The search for new drugs, including nanotechnologies that reduce the risk of development or overcome multiple drug resistance, and, consequently, significantly increase the effectiveness of treatment of dangerous infectious diseases, is an extremely important task [6].

Many purulent inflammatory diseases and postoperative complications are associated with antibiotic-resistant film-forming microorganisms, which are much more resistant than plankton forms [4]. The formation of biofilms by pathogenic microorganisms contributes to infectious lesions of both human organs and artificial implants. Biofilms are structures formed by microbial communities on the interface of phases, for example, liquid and solid, liquid and gaseous, etc. [13,20]. It is important to note that biofilms can be formed by bacteria of one species as well as represent a community, including several species of bacteria and other microorganisms. The microbial community itself consists of cells enclosed in an extracellular polymer matrix (exopolymer matrix) synthesized by them.

Biofilms play an important role in the process of transition of infectious disease from acute to chronic phase, being the cause of significant difficulties in the effective treatment of a large number of pathologies. In this regard, the search for means preventing the formation of biofilms and affecting bacteria inside them is an important task of modern antimicrobial therapy [23].

As a promising means of treatment of infectious and purulent-inflammatory diseases as an alternative to antibiotics, the properties of silver metal nanoparticles that exhibit a wide range of antimicrobial activity in the absence of resistance to them are being actively studied [7,21].

The toxic effect on bacterial cells is significantly determined by the size, shape, concentration, nature of the stabilizer of nanoparticles, as well as their ability to generate reactive oxygen species [9,15]. Silver nanoparticles are able to sorb on the surface of the bacterial cell, have a damaging effect on the plasma membrane and cause cell death.

Silver nanoparticles can also penetrate into bacterial cells and have a damaging effect on intracellular structures, ribosomal subparticles, nucleic acids and proteins [7,16,26]

Among the mechanisms of the toxic effect of silver nanoparticles on bacteria, their most important property is the ability to destroy the exopolymer matrix of biofilm [11,25]. This property acquires additional significance on the basis of the fact of the absence of nanosilver resistance in biofilms produced by multiresistant bacteria [19,22].

The nature and effectiveness of the toxic action of silver nanoparticles against film-forming microorganisms is largely determined by the nature of stabilizing biopolymers. The cytotoxic activity of silver nanoparticles stabilized with citrate [12], cyclodextrin [14], polyvinylpyrrolidone [5] and starch [17] against Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri, Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Escherichia coli, etc. has been demonstrated. One of the promising biopolymers that can be used for the recovery of metal nanoparticles from silver salts and their stabilization is natural water-soluble, nontoxic, easily accessible arabinogalactan from Siberian larch (Larixsibirica L.) and garden purslane (Portulaca oleracea) [3,18]. Steric stabilization of the surface of nanoparticles with arabinogalactan can significantly increase their stability and, while maintaining high antimicrobial activity, reduce toxic effects on the human body.

Thus, the problem of combating resistant film-forming bacteria dictates the need to develop effective drugs that can destroy the exopolymer matrix of biofilms and effectively affect bacterial cells. Development of approaches to the production and study of antimicrobial activity of silver nanoparticles against film-forming clinical strains of microorganisms is an urgent task.

In this work, we have obtained and characterized arabinogalactan stabilized silver nanoparticles. Their activity against clinically significant strains of filmforming microorganisms was studied.

MATERIALS AND METHOD

Preparation and characteristics of silver nanoparticles

For the synthesis of silver nanoparticles silver nitrate, ammonium hydroxide (27%), sodium dioctyl sulfosuccinate (Aerosol-OT, or bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate, sodium salt) (Labtex, Russia), arabinogalactan (Fluka) were used.

Synthesis of silver metal nanoparticles was performed by reduction of silver nitrate in alkaline medium in the presence of arabinogalactan. A solution of silver nitrate was added to 0.2% arabinogalactan solution heated to 90°C with intensive stirring. The silver reduction reaction was carried out for 40 minutes at the same temperature and pH≥10.0, followed by the addition of sodium dioctyl sulfosuccinate and gradual cooling of the solution to room temperature.

Electro kinetic potential of silver nanoparticles was determined by electrophoretic light scattering on the analyzer Photocor compact Z (Russia).

Studies using transmission electron microscopy were performed using a microscope LEO 912 AB (Carl Zeiss, Germany). Studies were carried out at an accelerating voltage of 100 kV. To prepare the samples, a drop of sol was applied to copper meshes with a diameter of 3.05 mm, covered with a thin polymer film-substrate, and dried at room temperature.

The distribution of silver nanoparticles size was determined by processing the obtained microphotographs using the program analysis of the optical images of UTHSCSA Image Tool 3.00.

Strains of microorganisms

Clinically significant strains of microorganisms that were most commonly found as pathogens of nosocomial and chronic infections were selected for the study; these bacteria were also characterized by resistance to beta-lactam antibiotics (Table 1).

The studied bacteria were isolated from hemoculture and various clinical biomaterials of the patients undergoing surgical treatment for coloproctological diseases. 17 strains of different species were studied to identify possible differences in drug interactions.

Study of the effect of silver nanoparticles on clinical isolates

1) The effect of the preparation of silver nanoparticles on the plankton form of microbial cells. To determine the sensitivity to silver nanoparticles, the minimum inhibitory concentrations (MIC) were measured in 96-well polystyrene plates using the method of successive two-fold dilutions.

The bacterial suspension was prepared in saline solution; the density of the suspension corresponded to 1 McF (3.3×108 CFU/ml). Dilutions of the preparation of silver nanoparticles were carried out in the cardio cerebral extract in the concentration range from 150 to 1.6 µg/ml. Bacterial suspensions with the drug were incubated in different concentrations for 48 hours at 37°C. Quantitative assessment of inhibition of microbial growth was carried out using the method of serial dilutions followed by sowing on a dense nutrient medium (trypton-soy agar) and counting CFU/ml after incubation at 37°C for 24 hours.

2) Inhibition of bacterial biofilm formation by preparation of silver nanoparticles. According to the method described above, bacterial suspensions from daily cultures with a density of 1.0 McF were prepared with the addition of silver nanoparticles in different concentrations. 1 ml of the suspension was applied to the cover glasses, kept for 4 hours to fix the cells, and then were added 5 ml of medium for biofilmogenesis (pepton-yeast extract) and the glasses were incubated in a thermostat for 48 hours at 37°C.

3) Destruction of daily biofilms by preparation of silver nanoparticles

1 ml of bacterial suspension of 1.0 McF was applied to the cover glasses and kept for 4 hours for fixing cells, after which were added 5 ml of medium for biofilmogenesis and the glasses were incubated for 24 hours at 37°C. On the glasses with the developed biofilm were applied to 1 ml of the test drug in various concentrations and they were incubated for a further 48 hours.

Biofilms were stained with alcian blue and microscopy was performed in a light microscope with a resolution of ×1000. The degree of biofilm formation was assessed by the developed conditional 4-point scale based on the nature of growth and the degree of coating of glass with bacterial film [1]. As a control, biofilm cultures were used, which were obtained under identical conditions, but without the addition of nanoparticles.

RESULTS AND DISCUSSION

Silver sol was obtained by reducing silver nitrate using arabinogalactan, which simultaneously acted as a reducing agent and stabilizer of nanoparticles. To increase the stability of silver sol to the obtained preparation was added dioctylsulfosuccinate sodium. According to transmission electron microscopy, the preparation contained nanoparticles of spherical silver (Fig. 1). The average diameter of nanoparticles was 11.4 nm (Fig. 2); Zeta potential – 24 mV.

At the first stage, the effectiveness of the preparation of nanoparticles on plankton cultures of microorganisms was studied. In the presence of the drug at a concentration of 75 µg/ml, the CFU/ml index in the case of all studied strains was 1-2 orders of magnitude lower compared with the control; at lower concentrations of the drug, the plankton growth remained unchanged. With an increase in the concentration of nanoparticles to 100 µg/ml, a sharp decrease in CFU/ml by 7 orders of magnitude was recorded (Table 2), which indicates the high bactericidal ability of silver nanoparticles. At a concentration of 120 µg/ml of plankton growth of microorganisms was not observed.

The obtained results indicate that the minimum inhibitory concentration (MIC) of the preparation of nanoparticles is 120 µg/ml. It should be noted that different representatives of the same kind of microorganisms in interaction with the preparation demonstrate similar reactions (Table 2).

Next, we investigated the effect of the preparation of silver nanoparticles on the biofilm formation. The studied strains of bacteria in the control samples, without the influence of inhibitory factors, for 48 hours formed biofilms of 3-4 degrees according to our evaluation scale (Fig. 3). In the presence of silver nanoparticles, the process of the biofilm growth was significantly decreased at concentrations ranging from 120 µg/ml and above and was evaluated as following the first degree (Table 3). When the preparation of nanoparticles was added at a concentration of 150 µg/ml, the growth of bacterial films was completely suppressed (Fig. 3).

Antibacterial agents that are effective in inhibiting the unformed biofilm can often be ineffective against microorganisms already enclosed in a film matrix. In our study, incubation of formed daily biofilms with the preparation of silver nanoparticles in the concentration range from 150 to 120 µg/ml for 48 hours led to partial or complete destruction of the biopolymer matrix (Table 4).

CONCLUSION

The obtained results show that the preparation of silver nanoparticles stabilized by the biopolymer arabinogalactan exhibits antibacterial activity against plankton cultures of all studied strains, suppresses the process of film formation, and also causes the destruction of formed biofilms in the same concentration range. Thus, the studied drug has great potential for use in the treatment of infectious diseases caused by film-forming microorganisms, as it will have a complex effect on them.

The authors declare no conflicts of interest.

REFERENCE

Назад к списку